转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路是一条重要的跨膜信号转导途径，在早期胚胎发育和调节成人组织稳态中发挥着重要作用，广泛存在于脊椎和无脊椎动物中。异常的TGF-β超家族信号与多种人类疾病相关，包括自身免疫、心血管、纤维化疾病以及癌症等。
生物体内的TGF-β信号持续激活II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体并与之结合形成较大分子量的异源复合物，随后募集、自动磷酸化II型受体；后者与I型受体结合后激活胞内的特异性靶分子(Smad蛋 白)，随后进入细胞核，在辅助因子的帮助下识别并结合目标基因启动子区域的特异性序列，扩增Smad依赖的靶基因转录[3]。信号通路在细胞内外受到严格而复杂的调控，通路中转导因子的活性在调节过程中影响巨大，任何信号转导因子活性改变都可能导致或促进肿瘤的产生及发展。TGF-β家族成员根据肿瘤的不同阶段释放抑制肿瘤或促进肿瘤进程的信号，不仅调控肿瘤细胞的活动，甚至对肿瘤微环境和机体产生巨大的效应。中药作为中华民族的医学瑰宝，在临床上应用了数千年，凭借多组分、多靶点、副作用小的特性在改善肿瘤患者的预后和生存率方面作用突出。对中药抗癌机制的研究发现，多种中药单体或复方可通过TGF-β/Smad信号通路影响肿瘤细胞的生命活动和肿瘤恶性转移、浸润等过程，为抗癌药的研发及肿瘤治疗提供新策略。
1 TGF-β/Smad信号转导通路TGF-β信号转导通路包含三部分：TGF-β超家族、TGF-β受体和Smads蛋白家族。
1.1 TGF-β超家族
TGF-β超家族由一类在结构和功能上相关联的细胞因子组成，包括两个功能组：TGF-β/激活素(Activin)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)/生长分化因子(growth and differentiation factor, GDF)。根据序列相似性将功能组进一步划分，TGF-β/Activin分支包括TGF-β、激活素、抑制素、节点和左配体；BMP/GDF分支包括BMP、GDF和苗勒管抑制素[4]。其中，骨形态发生蛋白是一类从骨基质中分离提取出来的酸性疏水性糖蛋白[5]，与Nodal/Activin在早期胚胎发育的体轴形成中起关键作用。苗勒管抑制素是一种产生于睾丸的颗粒细胞，具有抑制苗勒管发育的生理作用[9]。TGF-β是一组序列高度相关的细胞因子，已知有5种异构体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5)，习惯上将TGF-β1称为TGF-β[10]。TGF-β以无活性的形式分泌，它由成熟配体与潜伏相关蛋白(latency associated peptide, LAP)非共价连接的同二聚体组成，无活性的TGF-β不结合TGF-β的受体，也没有已知的生物学功能[11]。LAP是TGF-β前体的一部分，通过二硫键与另一个称为潜在TGF-β结合蛋白(latent TGF-β-binding protein, LTBP)的两个半胱氨酸残基进行化学交联，形成一种由TGF-β、LAP和LTBP三部分组成的潜在复合物(large latent complex, LLC)[12]。不同的细胞外蛋白酶可以裂解LTBP或LAP，将成熟的TGF-β从复合物中释放出来发挥作用[4]。有数据证实，TGF-β在多种肿瘤中过度表达，介导的信号通路在肿瘤中起着重要作用[13]。
1.2 TGF-β受体
TGF-β受体是一种普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，被配体激活后将胞外信号传递到胞内。TGF-β受体主要发挥介导作用的受体是三个高度同源的亚型：TβRI(TGF-β type I receptor)、TβRII和TβRIII。TβRI和TβRII由N-末端糖基化的胞外区、跨膜区和胞内C-末端丝氨酸/苏氨酸激酶区3个部分组成[14]。TβRI、TβRII的胞外区均含有大约10个半胱氨酸残基构成的区域，称为“Cys盒”。
TβRI胞
内侧近膜处有高度保守的调控区，称为GS结构域。GS结构域是一个关键的调控区域，包含一个特殊的SGSGSG序列，可能控制I型受体激酶的催化活性或与底物的相互作用。TβRII胞内侧羧基端富含Thr和Ser的短尾，因此它可自主激活。TβRII与TGF-β特异性结合并与TβRI形成异源复合物，磷酸化2型受体GS结构域启动胞内的信号级联反应。TβRIII无激酶活性不参与TGF-β信号的传导，可促进和拮抗受体结合配体，促进作用通过与TβRI、TβRII形成复合物结合配体实现。
1.3 Smads蛋白家族
Smads蛋白群是TGF-β家族中重要的一类信号转导和调节分子。激活的Smads可通过与转录因子结合，调节各种不同的生物学效应。在脊椎动物中共发现8种不同的蛋白，根据功能的不同分为三种亚型：受体激活型Smad(R-Smads)、共同型Smad(Co-Smads)和抑制型Smad(I-Smads)。所有Smad蛋白一级结构包括Mad同源结构域N端区(mad homo logues 1, MH1)、C端区(MH2)和中间连接区，MH1介导DNA结合，MH2介导Smad寡聚化[11]。
R-Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。R-Smads均有一个C端SSXS基序，最后两个丝氨酸可被I型受体直接磷酸化。Smad2、Smad3转导TGF-β/Activin通路信号。Smad1、Smad5、Smad8作为TGF-β家族中骨形态发生蛋白(BMP)通路受体底物参与信号转导[18]。Co-Smad仅有Smad4。Smad4中间连接区富含脯氨酸，是转录激活的必需区域，可以与所有MH2区域被磷酸化的R-Smad蛋白结合形成异源三聚体[19]。I-Smads分为Smad6、Smad7，两者均为抑制因子负反馈调控TGF-β/Smad通路的活性。Smad7可经由p300介导的乙酰化参与TGF-β引发的转录调控[20]，其拮抗信号传递的机制与竞争性结合受体I，阻断受体激活型Smad的活化有关[21]。Smad6除了与Smad1竞争结合Smad4，还可以与共抑制子CtBP协同作用于BMPs信号通路，起到负调控该信号通路的作用[22-23]。
Smad基因突变或功能失活导致人体多种病理进程的发生，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切[24]。
2 TGF-β/Smads信号转导通路与肿瘤TGF-β/Smads通路在肿瘤发生过程中随阶段不同表现出相反的调节效果。在生理阶段以及肿瘤发生早期，TGF-β抑制作用通过促进细胞周期停滞、诱导细胞凋亡、抑制生长因子、细胞因子和趋化因子的表达得以实现。在肿瘤进展的后期阶段，该通路的核心组成部分由于突变或杂合性等位基因缺失而丧失活性，造成抑制肿瘤TGF-β信号消失，并伴有抑制机体免疫监控系统，协同肿瘤血管生成，形成适于肿瘤浸润、转移的胞外微环境等反应[25]。
2.1 TGF-β/Smads与肿瘤的生长
在正常的生理情况下，TGF-β可干扰细胞的正常周期抑制细胞增殖，或通过促凋亡作用抑制肿瘤发生。TGF-β受体和Smad蛋白的结合可将有关TGF-β信号转导到胞内，促进G1期细胞周期停滞抑制其增殖[26-27]。在上皮细胞中，TGF可以通过上调细胞静态蛋白，如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKI)、p51和p21，同时下调生长刺激蛋白，尤其是c-Myc和Id(inhibitors of differentiation)家族成员来触发细胞周期阻滞[28]。有丝分裂转录因子c-Myc的表达抑制可使下游蛋白CDK对细胞周期抑制蛋白p15Ink4b和p21Cipl的抑制作用丧失，且通过Smad信号联合其他通路导致肿瘤细胞丧失增殖能力[29]。同时，TGF通过对Id家族的转录抑制使细胞丧失分化功能，导致生长停滞。例如TGF可通过激活Smad3直接促进应激反应因子(activating transcription factor 3, ATF3)的表达，使得ATF3和Smad3形成一个复合物，直接介导Id1抑制[30]。在上皮细胞和肿瘤初生期间，TGF-β作为肿瘤抑制因子借助Smad2/Smad3信号转导通路抑制恶性细胞的生长[31]。TGF-β可在一些细胞类型中作为凋亡诱导物介导基因反应引起细胞凋亡，如TIEG(TGF-β-inducible-early-response gene)可在胰腺上皮细胞中被TGF-β诱导表达促使细胞凋亡[32]。
2.2 TGF-β/Smads调控肿瘤的浸润和转移
TGF-β在肿瘤发生晚期发挥促癌作用，通过诱导上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transi tion, EMT)、刺激肿瘤血管生成、协同肿瘤逃避免疫监视及合成适宜的胞外基质微环境促进肿瘤的浸润和转移。EMT是上皮细胞摆脱许多上皮特性获得各种间充质细胞特征的过程，该过程受到特定细胞因子的调控，如Snail/Slug、ZEB1/2等[33]。
EMT过程导致肿瘤细胞的黏着特性减弱而转移特性增强，局部浸润后进入淋巴管和血管被输送到全身，是肿瘤细胞获得迁移能力的重要机制之一。在上皮-间充质转换过程中，上皮细胞-细胞黏附蛋白，如E-钙黏蛋白、ZO-1(zonula occludens-1)和阻塞素等的表达下调，而如N-钙黏蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等的表达上调[34]。其中，E-cadhetin表达缺失被认为是细胞发生EMT作用的重要标志，TGF-β可通过影响多种转录因子如Id、SKIP(ski interacting protein)、MRTFs(myocardin-related transcription fac tors)、Snail、ZEB等，使得E-cadherin表达缺失[35]。
有研究证实，Smad3、Smad4在EMT过程中发挥至关重要的作用[36]。Smad3可与多种与EMT作用有关的转录因子直接或间接结合影响E-cadherin的表达，促进EMT的发生。Smad2也被证实可与Ha Ras致癌基因合用增强癌细胞中的EMT作用[37]。多种中药成分通过降低P-Smad2/3及EMT诱导转录因子Snail、E-cadherin的含量抑制肿瘤的转移、侵袭，TGF-β/Smad信号通路是中药靶向调控EMT作用的关键[38-40]。
血管生成为肿瘤提供所需的营养，TGF-β促进持续的血管生成有利于侵袭和转移[41]。低水平的TGF-β通过上调血管生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、bFGF(basic fibroblast growth factor)、CTGF(connective tissue growth factor)和蛋白酶的表达和活性间接促进血管生成[42-43]。同时，TGF-β可诱导金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和MMP-9的表达，负调控金属蛋白酶抑制因子，增加微环境中的蛋白酶。MMPs是促进血管内皮基底膜降解最重要的酶系，其活性增强可促进肿瘤血管新生[44]。
免疫系统的监视作用具有识别、杀伤并及时清除体内突变细胞，防止肿瘤发生的功能，是机体抗肿瘤发生的重要屏障。TGF-β通过影响多种免疫细胞的增殖、分化和存活发挥抗肿瘤免疫的不良作用，显著抑制宿主肿瘤免疫监视[45]。TGF-β通过抑制自然杀伤细胞和CD8+-CTL(细胞毒T淋巴细胞)的功能，阻断穿孔蛋白、颗粒酶和细胞毒素等关键蛋白的“细胞毒程序”[46]。另外，TGF-β诱导Treg和Th17细胞分化，抑制B细胞增殖和IgA分泌，干扰细胞免疫功能。Smad2/3/4对iTreg细胞的分化都很重要，然而对于Th17细胞的生成，Smad2是必要的，而Smad3/4是可有可无的[47]。此外，TGF-β抑制树突状细胞的功能成熟，阻断I型巨噬细胞和中性粒细胞的发育，促进II型巨噬细胞发育，介导髓样免疫抑制细胞(myeloid immune suppressor cells, MISCs)的免疫抑制功能使得肿瘤脱离免疫系统控制，导致肿瘤在宿主体内的浸润、转移。不仅如此，与肿瘤相关的免疫微环境中多种免疫因子是肿瘤EMT的有效诱导因子[48]。
实体肿瘤的基质组织结构复杂，由ECM(extracellular matrix)蛋白(主要是I型胶原)和多种细胞类型组成，包括间充质细胞、内皮细胞、神经细胞、免疫细胞和骨髓源干细胞等[49]。这些细胞均表达TGF-β受体，因此TGF-β途径异常可产生微环境纤维化、血管生成和免疫细胞浸润等利于恶性肿瘤转移的条件。癌细胞生成的TGF-β1激活周围环境中的癌症相关成纤维细胞，激活的癌症相关成纤维细胞分泌各种促进肿瘤生长、侵袭、转移和对化疗抵抗的因子，包括EGF、IGF-1(insulin like growth factor-1)、PDGF(platelet-derived growth factor)、FGF、MMP等，这些因子造成的低氧微环境对更具侵袭性的癌细胞表型具有选择性[50]，进一步增强恶性肿瘤的侵袭力。Smad4的突变失活被证实有助于创造有利肿瘤的微环境[51]。
3 中药成分通过TGF-β/Smad通路对肿瘤细胞的调控作用
3.1 对肿瘤细胞生长的调控作用
李妍等[52]研究发现，姜黄素具有拮抗小鼠Lewis肺癌原发瘤微血管形成，导致瘤体生长受阻的作用。免疫组化检测显示，姜黄素可上调拮抗因子Smad7的表达，下调Smad3的表达。他们推测，姜黄素对瘤体生长的抑制作用一方面通过增加Smad7的表达量，减少TGF-β1在瘤体中的过度表达；另一方面通过减少Smad3的表达阻断TGF-β通路的信号传递，达到降低肿瘤新生血管密度、抑制瘤体生长的目的。因此，姜黄素对瘤体生长的抑制是通过TGF-β/Smad通路得以实现的。血根碱(sanguinarine, SA)是从罂粟科植物博落回中分离出的一种苯并菲啶异喹啉类生物碱，可对多种类型的癌细胞产生细胞毒性[53]。有研究发现，血根碱通过增加卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol对紫杉醇的敏感性来增强药物的毒性作用，逆转肿瘤细胞对紫杉醇的耐药现象，促进卵巢癌耐紫杉醇细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。研究结果显示，血根碱可显著抑制TGF-β1、正调控因子Smad3表达，上调负调控因子Smad7表达[54]，其抗肿瘤作用可能是抑制TGF-β/Smad途径活性进而促进卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol凋亡[54]。
3.2 对肿瘤细胞浸润、转移的调控作用
靳祎祎等对白花蛇舌草的研究发现，其乙醇提取物具有抑制大肠癌细胞增殖及迁移、侵袭的作用。Transwell实验结果证实，白花蛇舌草乙醇提取物对大肠癌HCT-8细胞转移有显著的抑制作用。Western blot结果显示，经白花蛇舌草乙醇提取物干预后，EMT相关蛋白表达受到干扰，N-cadherin、Vimentin表达被抑制，E-cadherin表达量增加；同时TGF-β通路中重要因子TGF-β、Smad4的表达被明显下调，P-Smad2/3复合物表达量与正常表达的Smad2/3复合物相比被显著抑制。他们的研究揭示，白花蛇舌草抑制大肠癌细胞转移的机制可能是抑制TGF-β/Smad信号通路激活EMT。李慧杰等[56]研究表明，芪连扶正胶囊含药血清抑制肺癌A549细胞的迁移，抑制效果随浓度增加而增强，在联合化疗条件下效果尤甚。芪连扶正胶囊可通过下调Smad7、TGF-β1 mRNA的表达，抑制TGF-β/Smad通路过度兴奋，防止肺癌细胞上皮-间质化转变发生，产生抗肿瘤侵袭、转移的效果。消岩汤是以白花蛇舌草、夏枯草、生牡蛎为君药，联合郁金、姜黄、黄芪与太子参组成的中药复方，在临床应用中抗癌效果显著。李小江等[57]证实，消岩汤在体外环境中对非小细胞肺癌细胞的转移有抑制作用，RT-PCR显示实验组炎性因子TGF-β表达受到明显抑制，Western blot检测的P-Smad3及MMP-9的蛋白表达均被下调，提示消岩汤的抗肿瘤转移作用机制可能与抑制非小细胞肺癌微环境中TGF-β/Smad3信号通路的转导有关。
4 问题与展望在多种实体瘤中，不同中药复方或单体通过TGF-β/Smad通路对肿瘤生长、增殖、侵袭及转移等活动产生显著的抑制作用，明显改善晚期肿瘤患者的生存和预后情况，但具体的机制以及与其他通路的协同作用十分复杂，仍待进一步研究。
同时，对于中药靶向EMT研究虽取得一定进展，参与EMT作用的通路及相关分子是中药发挥抑制调控作用的重要靶点，但需要进一步的研究确定中药调控作用的分子机制以及与其他通路的联系。深入研究EMT作用的调节分子，确认与其他通路之间的共调节分子可能为中药抗癌药的研发提供新的作用靶点。（作者：王仕娇，王 纯，张 敏，陈思敏，陈金铭，胡 卫，曾建红，陈 涛）